生成的タンパク質設計は、致死性のヘビ毒毒素を含む多様な標的に対して、高親和性と機能活性を備えたデノボ結合体を迅速に作製できるようになってきた。しかし、これまで報告されてきた成功例の多くは、新規性の高い足場（スキャフォールド）に依存しており、治療的な先例は限られていた。単一ドメイン抗体（VHH）は臨床的に検証された別の足場であり、ヘビ毒に含まれる最も致死性の高い成分の一つである長鎖α-神経毒素に結合し中和できる。本研究では、単眼コブラ（Naja kaouthia）のα-コブラトキシンに対してVHHを生成する能力をもつ、近年確立された3種類のデノボ設計モデル（Germinal、RFantibody、BoltzGen）を比較した。AlphaFold3の界面信頼度（ipTM）とRMSD自己整合性に基づく評価基準、および標準化したモデル入力を用いて、実験的評価のための厳格なin silico基準を満たす設計を生成できたのはGerminalのみであることを見いだした。そこで、3つの異なるVHHフレームワークを用いたより大規模なGerminal設計キャンペーンを実施し、in vitroで46設計を実験的に検証した。そのうち42件は可溶性タンパク質として発現し、試験した3つのうち2つのフレームワークに由来する4件の結合ヒットを同定した。4件のバインダーのうち、2つのリード候補をさらに特性評価し、高親和性（KDが4.1 nMおよび10.8 nM）、単量体としてのふるまい、低ポリ反応性を示した。これらは好ましい生物物理学的・開発可能性の特性、ならびにin vitroでの機能的トキシン中和能を示していた。治療ポテンシャルを評価するため、α-コブラトキシン毒性からのin vivo防御能を調べた。両候補はいずれもα-コブラトキシンのチャレンジ後にマウスを完全に保護し、致死性対照と比較して生存率100%を示した。一方の候補は、Naja kaouthiaの全毒に対しても顕著な中和能を保持し、生存率56%を示したが、他方は救済設定で試験したところ22%を保護した。以上より、デノボVHH設計は、致死的なコブラ毒の神経毒性に対するin vivo防御を伴う高親和性の単一ドメイン抗体を生成でき、方法およびフレームワークに依存した性能に関する実践的知見を提供することを示した。
https://doi.org/10.64898/2026.09.01.748349