背景：間葉系ストローマ細胞由来コンディショニングメディウム（MSC-CM）は、細胞を用いない再生医療の有望なアプローチとして位置づけられている。しかし、作製条件のばらつきが標準化の主要な課題として残っている。本研究では、無血清条件付け期間がヒト歯髄幹細胞コンディショニングメディウム（DPSC-CM）のプロテオーム構成と再生活性に与える影響を検討した。
方法：DPSC-CMは無血清条件付け24、48、72時間後に採取し、ドナー遮断による差次的存在量解析を用いたラベルフリーLC-MS/MSプロテオミクスで特徴づけた。DPSCの生存率とアポトーシスはAnnexin V/PIフローサイトメトリーで評価した。CM 48時間およびCM 72時間の血管新生活性は、エキソボボ（ex ovo）ニワトリの漿尿膜（CAM）アッセイで評価し、全てのCM群についてヒトの自然脱落乳歯由来歯牙細胞（SHED）の代謝活性および骨形成分化への影響を評価した。骨形成はアルカリホスファターゼ（ALP）およびアリザリンレッドS（ARS）染色で評価した。PI3K/Aktシグナル伝達はCM 48時間についてWestern blottingで調べた。
結果：無血清条件付けを最大72時間行っても、DPSCの生存率またはアポトーシスは有意には変化しなかった。プロテオーム解析により1562種のタンパク質を同定した。差次的存在量解析では、CM 48時間とCM 24時間の間で914個の差次的存在量タンパク質（DAPs）を同定し、CM 72時間とCM 24時間の間では745個を同定した。一方で、CM 72時間とCM 48時間の間ではDAPは検出されなかった。濃縮された生物学的プロセスには、細胞外マトリクスの組織化、細胞—基質接着、細胞骨格の組織化、タンパク質フォールディング、ならびに血管新生関連経路が含まれた。CAMアッセイでは、CM 48時間は総血管面積を増加させ、CM 72時間は総血管長を増加させた。CM 48時間はday 3におけるSHED代謝活性を増強した。ALP染色は群間で有意差を示さなかったが、CM 48時間はCM 24時間よりもマトリクスの鉱化を強く示した。PI3K阻害によりAktのリン酸化は低下したが、CM 48時間はp-Akt/Akt比に有意な影響を与えなかった。
結論：無血清条件付け期間はDPSC-CMの組成と生物学的活性を規定し、主要なプロテオームの移行は24時間から48時間の間で起こった。評価した条件付け期間のうち、48時間はプロテオームと機能の効果の組合せとして最も一貫しており、DPSC-CM作製のための候補条件付け期間としてさらなる検討を支持する。
https://doi.org/10.20944/preprints202609.0224.v1