遺伝子欠失のためのCRISPR-Casヌクレアーゼによるノックアウトは、標的DNAの切断とエラーを伴うDNA修復に依存している。末端結合経路では、挿入や欠失が生じてタンパク質コード配列の破壊を助けることがある。しかし、所望の編集が達成されるのは全体の一部に限られ、好ましくない修復結果の組合せが典型的には別の編集技術への切替を必要とする。修復に影響する主要因は、切断後に生じるDNA末端の種類と長さである。ここでは、Cas12aが異なる末端を作り出す能力と、それらを編集結果の再配分に用いることができるかを調べた。ヌクレオチド分解能アッセイと速度論的モデリングを組み合わせることで、in vitroにおけるCas12aによる標的切断の部位と速度を決定した。初めて、トリミング、すなわち一度切断された標的への繰り返し切断が、初期の切断よりも約4倍速く起こることを示すとともに、細胞内修復のための代替的なDNA末端構造が現れることを示した。次に、gRNAに特定のミスマッチを導入した。Cas12aは高速な標的切断を維持したが、マッチしたgRNAと比べて、標的が切断される位置およびトリミングの速さが変化した。マッチ型およびミスマッチ型gRNA間の切断ダイナミクスの相違を利用して、再プログラム化gRNA、すなわちrpgRNAを開発した。意図的ミスマッチのrpgRNAは、従来のgRNAで観測される高い編集効率を保持した。しかし、編集をin-frameとout-of-frameの間で振り分け直し、遺伝子をまたいだ遺伝子ノックアウト成功を高めた。再プログラム化gRNAは、CRISPR-Casヌクレアーゼによる遺伝子編集の単純さを保ちながら、望ましい結果へ向けて編集を効率よく誘導する方法を提供する。
https://doi.org/10.64898/2026.08.31.748204