クライオ電子トモグラフィー（cryo-ET）は細胞内構造のネイティブに近い可視化を可能にするが、網膜のような中程度の厚みをもつ多層組織への適用は、不十分なガラス化と不正確な深さターゲティングによって妨げられる。ここでは、これらの障壁を克服するために、改変高圧凍結、クライオ超ミクロトームによるトリミング、プラズマベースのクライオFIBミリングを統合した手法であるPLCTを開発した。PLCTは最小限の氷アーティファクトで直径<100 μmの網膜スライスを確実にガラス化し、形態学的ランドマークにより外網状層へ精密にナビゲートして、高分解能cryo-ETに適した高品質ラメラを作製する。サブトモグラム平均化（STA）解析により、網膜水平細胞の突起内の16.33 Åに微小管が同定された。さらに重要な点として、STAは同じ突起において24.81 Åで10 nm直径の糸状構造も解像し、その構造は、中心密度が伸長した形状の周囲に6本の末梢ストランドが取り囲み、介在する空隙が連続しているという特徴を備えていた。この構成は中間径フィラメントと整合する。これらは、ネイティブな局在と免疫反応性とともに、当該フィラメントが神経フィラメントであることを総合的に示す。別途、シナプスリボンの3D再構成では、これまで未認識だった「麻雀牌」様の微細超構造が明らかになった。これらの結果は、PLCTで作製したラメラがネイティブ組織における構造解析を支えるのに十分な品質を持つことを示す。実証は網膜視細胞シナプスでのプルーフ・オブ・プレンシプルとして行われたが、PLCTは本質的に一般化可能であり、深さナビゲーションとガラス化戦略は任意の多層組織へ直接適用できる。本研究は、多層組織の深さ分解インサイcryo-ETのための、頑健で再現可能なPLCTプラットフォームを確立する。
https://doi.org/10.64898/2026.08.25.746966