回転モーターであるF1-ATPaseはモデル分子機械として広く研究されてきたが、ATP加水分解の合理的な工学的改変は、長距離のサブユニット間オロステリック相互作用と大きな構造変化によって制御されるため依然として困難である。ここでは、好熱性 Bacillus PS3 F1-ATPase（TF1）の最大回転速度を増大させるための、相同性に基づく工学戦略を開発した。まず、TF1と、その最大回転速度がTF1より高い相同酵素であるウシミトコンドリアF1（bMF1）およびParacoccus denitrificans F1（PdF1）を比較することで、候補変異部位を同定した。これらの部位に対する体系的探索により活性を高める4つのホットスポットを見いだし、次いでホットスポットに焦点を当てた探索と、組合せ変異体に対する機械学習支援による優先順位付けを行った。最良の変異体であるTF1（βY313L/βE332S）は、機能的な耐熱安定性を維持しつつ、TF1（WT）に比べて最大回転速度を1.8倍高めた。興味深いことに、活性を高める置換は、bMF1とPdF1の両方に保存された残基に限定されなかった。これは、bMF1とPdF1のコンセンサス置換が、最適なアミノ酸を一意に定義するというより、活性を高めるホットスポットを有効に同定することを示唆する。機械学習支援による探索は高活性変異体を効率的に優先したが、比較的小さな学習データセットと、変異間のエピスタシス相互作用によって予測性能は限定された。速度論的および構造的比較により、設計した変異体の触媒活性増強の機構的知見も得られた。これらの結果は、相同性に基づくホットスポット同定とホットスポットに焦点を当てた探索を組み合わせることで、複雑な分子モーターを実用的に設計するための戦略を確立するものである。
https://doi.org/10.64898/2026.08.27.747693