次世代シーケンシング（NGS）による原核生物の16S rRNA遺伝子の解析は、約20年前に腸内マイクロバイオーム研究に革命をもたらした。しかし、短鎖リード長は、広く用いられているIlluminaプラットフォーム（2×150〜300 bp）に固有の制約である。Oxford Nanopore Technologies（ONT）のフローチップ化学（R10.4.1）における近年の進歩は、シーケンシング精度を大きく改善した。これに、16S rRNA遺伝子の変異体を包括的に標的してほぼフルレングス増幅産物を生成するカスタムの複数プライマー戦略を組み合わせることで、リードごとの分類同定が可能となり、短鎖シーケンシングでは実現できない特徴が得られる。複数プライマー戦略は18,000試料超を並列に配列可能にする可能性がある（192×96）が、現在のフローチップ容量では約1,000〜1,500試料に十分なシーケンシング深度が得られるにとどまる。スケーラビリティとリードごとの分類パイプラインを検証するために、ヒト糞便マイクロバイオームに由来しない2つの細菌株（Imtechella halotoleransおよびAllobacillus halotolerans）をスパイクした1,000超のヒト糞便サンプルを、単一フローチップで配列できることを示す。これにより、リードごとの直接分類同定に十分な分子あたりのエラー率と、下流解析に適したリード深度が達成される。こうしたスケーラビリティの水準は、試料あたりのコストを大幅に低減し、より広い研究コミュニティに本アプローチを利用しやすくする。これらの進歩を取り込むために、RubyRedというパイプラインを開発し、rawなシーケンスデータを処理してリードごとに分類同定を割り当てる。スパイクイン参照（I. halotoleransおよびA. halotolerans）を用いて、平均的な単一リード配列精度が高いこと（それぞれ99%および98.9%）を示し、16S rRNA遺伝子に基づく種レベル分類同定に必要な標準的しきい値を超えるリードが大多数を占めることを明らかにする。
https://doi.org/10.64898/2026.08.29.747698