下流の用途、例えばナチュラル質量分析（nMS）に必要な十分量の高純度タンパク質を得ることはしばしば困難であり、特に発現収量が低い場合やタンパク質が不安定な場合に顕著になる。このような場合、一般に必要とされるバッファ交換工程は主要なボトルネックとなることが多く、タンパク質の顕著な損失を招き、生物物理学的な特性評価を損なう。これらの課題は、タンパク質収量が通常細菌よりも低い昆虫または真核生物の発現システムでさらに悪化し、精製中のタンパク質損失が特に深刻な問題となる。標準的な溶解および精製バッファには、Tris、リン酸、HEPES、塩化ナトリウムのような非揮発性成分が含まれており、これらはエレクトロスプレーイオン化（ESI）中に付加物を形成して信号を妨害するため、nMSの前に除去する必要がある。
この必須のバッファ交換に伴うタンパク質損失に対処するため、我々は親和性精製ワークフローを評価した。この手法では、精製の全工程を通じて非揮発性塩を排除し、タンパク質をnMS対応の酢酸アンモニウムベースのバッファへ直接溶出する。これにより、別個のバッファ交換工程が不要となり、親和性精製の直後に迅速なnMS解析が可能になる。我々は、HisおよびStrepベースの親和性精製で一般に用いられる溶出液、例えばイミダゾール、ビオチン、ジスチオビオチンが、適切な濃度において十分に許容されることを示す。これにより、タンパク質のストイキオメトリー決定や、酵素反応またはアセンブリ過程のモニタリングに適した高品質なスペクトルを取得できる。したがって、この高速化した親和性ワークフローはタンパク質回収を増大させ、試料調製を短縮し、さらにオンラインの交換プロトコルを補完する。オンライン交換プロトコルは、過程のモニタリングにはあまり適していない。その結果、このアプローチにより、従来の精製およびバッファ交換戦略では十分量を得るのが難しいタンパク質およびタンパク質複合体へのnMSの適用範囲が拡大する。
https://doi.org/10.1101/2025.02.22.639503